Full Name of the work head: Жигайлов Андрей Викторович
Исполнители проекта:
: Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения "Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина"
Inventory number: 0322РК01179
Registration number: 0122РК00825
Keywords: биогенез рибосом,генетическая инженерия,рибосомный белок S6 (RPS6),Трансляция мРНК,фосфомиметическая замена аминокислот
- Проведен компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей мРНК, кодирующих рибосомный белок S6 Arabidopsis thaliana (AtRPS6), разработаны, синтезированы и очищены праймеры для клонирования и мутагенеза открытых рамок считывания (ОРС) двух изоформ этого белка.
- Из семян выращены растения A. thaliana, из их листьев выделены тотальные препараты РНК, использованные в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции с использованием реверсного праймера, комплементарного консервативному участку 3’-нетранслируемой последовательности мРНК, кодирующих рибосомный белок S6.
- С использованием специфических праймеров проведена амплификация кДНК, включающих ОРС, кодирующих изоформы А и B этого белка. Амплификаты обработаны рестрицирующими эндонуклеазами NdeI / BamHI и клонированы в вектор pET23c по тем же сайтам рестрикции. Проведен скрининг ДНК-клонов методом рестрикции и ПЦР.
- Методом мутагенеза in vitro с использованием высокоточной полимеразы Phusion в три этапа проведено мутирование триплетов, кодирующих серин и треонин на С-конце белков AtRPS6A и AtRPS6B, на кодон глютаминовой кислоты (GAA и GAG). Корректность внесенных нуклеотидных замен выверена методом секвенирования ДНК по Сэнгеру.
