Full Name of the work head: Балтин Кайрат Канатович
Исполнители проекта:
: Товарищество с ограниченной ответственностью "Национальный центр биотехнологии"
Inventory number: 0322РК00595
Registration number: 0121РК00225
Keywords: Антиген,Белок,Вирус,Диагностика,ИФА,Конъюгат
На основании анализа аминокислотной последовательностей указанных белков выбраны фрагменты SpA (59 а.о.) и SpG (197 а.о.), которые по расчетам будут обладать высокой связывающей активностью с антителами IgG млекопитающих. На основании аминокислотной последовательности фрагментов белков SpA и SpG и HRP (Armoracia rusticana) (329 а.о.) синтезирована полная нуклеотидная последовательность гена фьюжен белка SpA/SpG-HRP, которая имела протяженность 2121 п.о. Путем клонирования фрагментов генов SpA, SpG и гена пероксидазы хрена в составе вектора pPICZαA, получена экспрессионная генно-инженерная конструкция pPICZα/SpA-SpG-HRP. Индуцированная 1% метанолом культура продуцировала рекомбинантный конъюгат SpA/SpG-HRP до 120 мкг/мл. Наработана культура рекомбинантного штамма-продуцента конъюгата SpA/SpG-HRP в объеме 200 мл. Индукцию культуру проводили в течение 120 часов путем ежедневной подпитки 1% метанолом в качестве единственного источника углерода. Очистку рекомбинантного белка SpA/SpG-HRP проводили с помощью металлоффинной хроматографии на ионах Ni2+ с использованием Ni-NTA и хроматографическим способом путем элюции градиентом имидазола (50-300 мМ) очищен рекомбинантный конъюгат SpA/SpG-HRP. Полученный рекомбинантный конъюгат SpA/SpG-HRP проверяли на антителосвязывающие свойства на сыворотках крови людей и ферментативную активность на пероксидазу, которая составила 0,25 U/ml (по методу с пирогаллолом). Установлено, что SpA/SpG-HRP связывается с IgG человека в разведении 1/20 000.