Full Name of the work head: Мамадалиев Сейдигапбар
Исполнители проекта:
: Товарищество с ограниченной ответственностью "Национальный центр биотехнологии"
Inventory number: 0322РК00320
Registration number: 0121РК00194
Keywords: вирус блютанга,катаральная лихорадка овец,полимеразная цепная реакция,секвенирование,тест-система
Из десяти ОТ-ПЦР положительных образцов выделены тотальные препараты РНК, проведена реакция обратной транскрипции с использованием высокопродуктивной ревертазы Superscript IV. С этих десяти образов синтезированной кДНК получены амплификаты с использованием высокоточной ДНК-полимеразы (сегменты 2 и 10).
Проведена генетическая характеризация изолятов вируса блютанга по частично секвенированным Seg-2 и Seg-10 с последующим проведением филогенетического анализа. По обоим локусам все образцы кластеризовались с образцами генотипов вируса BTV-9W.
Для одного из изолятов вируса проведено частичное секвенирование всего генома (всех десяти сегментов РНК). Реассортмента не выявлено: все сегменты генетически ближе всего оказались к вакцинным штаммам топотипа BTV-9W.
Разработаны, синтезированы и очищены праймеры и пробы для детекции РНК BTV всех серотипов по локусу Seg10 и дифференциальной диагностики РНК-сегмента Seg-2 топотипа BTV-9W методом ПЦР в реальном времени (RT-qPCR).
Проведено клонирование участка сегмента Seg2 и фрагмента ДНК, соответствующего полнодлинному сегменту Seg10 BTV-9W в экспрессионный вектор pET23c. Проведен рестрикционный и ПЦР-анализ клонов для подтверждения наличия в плазмидах требуемых вставок ДНК.
Сконструированные плазмиды T7-BTV-9WSeg2[1595-2564]_pET23c и T7-BTV-9WSeg10[1-803]_pET23c были линеаризованы по сайтам SalI и SacI соответственно, после чего методом транскрипции in vitro с них проведен синтез контрольных РНК для тест-системы.