Full Name of the work head: Абельденов Сайлау Касенович
Исполнители проекта:
: Товарищество с ограниченной ответственностью "Национальный центр биотехнологии"
Inventory number: 0322РК00471
Registration number: 0121РК00039
Keywords: ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ,ПАТОГЕН,РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК,РЕПАРАЦИЯ ДНК,ТУБЕРКУЛЕЗ
3. Была охарактеризована ДНК- субстратная специфичность ферментов TagA и Ung. Для определения репарационной активности в условиях in vitro были использованы 30-мерные субстраты, представляющие собой синтетические олигонуклеотиды, имеющие в 11 положении модифицированные основания – урацил, этеноцитозин, гипоксантин, аналог АП-сайта тетрагидрофуран, 24-мерные субстраты с метилированными гуанином и аденином (dG-24-c5 и dA-24-c5). Олигонуклеотиды были химически модифицированы с 5’ конца флуоресцентными метками – TAMRA (тетраметилродамин) и Сy5.
4. Определены кинетические параметры констант связывания белков TagA и Ung с радиоактивно/флуоресцентно мечеными ДНК-зондами. Определение репарационной активности проводили с помощью реакционного буфера для измерения активности Ung H. pylori, который имел в своем составе 10 нМ TAMRA -меченный олигонуклеотидный дуплекс, 20 мМ Tris–HCl (pH 8,0), 0,1 мг•мл–1 БСА, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ. На основе полученных данных были рассчитаны кинетические параметры репарационных активностей: константа Михаэлиса (KM), каталитическая константа (kcat), эффективность действия фермента (kcat/KM). Скрининг условий выполняли с использованием коммерческих растворов из наборов Index HT, PEG/Ion HT компании Hampton Research и ProPlex компании Molecular Dimensions в 96-луночных планшетах методом диффузии в паре «висячей капли» для кристаллизации.
