Структурно-функциональное исследование ферментов репарации ДНК у Staphylococcus aureus
Руководитель проекта: Абельденов Сайлау Касенович
Исполнители проекта:
Организация: Товарищество с ограниченной ответственностью "Национальный центр биотехнологии"
Инвентарный номер: 0222РК00432
Регистрационный номер: 0120РК00278
Ключевые слова: STAPHYLOCOCCUS AUREUS,ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ,ПАТОГЕН,РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК,РЕПАРАЦИЯ ДНК
Была подтверждена принадлежность S. aureus с помощью секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК и анализа белкового профиля. Амплифицированные из геномной ДНК S. aureus гены nfo и dnaN, кодирующие АП эндонуклеазу Nfo и β-субъединицу ДНК-полимеразы III DnaN, соответственно, были клонированы в экспрессирующие вектора. Секвенирование полученных рекомбинантных векторов подтвердило отсутствие мутаций.
Скрининг репарационной активности с использованием как бесклеточного экстракта S. aureus, так и рекомбинантного белка выявил наличие AП-эндонуклеазной, NIR- и 3'→5'-экзонуклеазной активности. Выделение и характеристика рекомбинантного белка SaNfo подтвердили, что фермент обладает AП-эндонуклеазной и NIR-активностями. Выявлено, что мутант E258Q приводит к полному отсутствию активности репарации ДНК. Функциональная важность SaNfo была подтверждена in vivo его экспрессией в штамме E.coli BH110 с дефицитом АП эндонуклеаз.
Было обнаружено, что β-зажим S.aureus в несколько раз стимулировал активность SaNfo расщепления АП сайта за счет снижения неспецифического связывания фермента с ДНК и увеличения скорости оборота. Проведены работы по кристаллизации и получена структура фермента.
В результате проведенных работ проведена структурно-функциональная характеристика SaNfo.