Новые подходы для изучения и количественного анализа убиквитинирования in vivo, на основе метода биотинилирования от сближения
Full Name of the work head: Раманкулов Е.М.
Исполнители проекта: Кулыясов А.Т., Жубанова Г.С.
: Национальный центр биотехнологии
Inventory number: 0215РК02355
Registration number: 0115РК01802
Keywords: плазмиды*убиквитин*протеомика*масс-спектрометрия*иммуноблот*рекомбинантные белки*биотинилирование белков
Рассмотрено получение новых данных о взаимодействиях и идентификации мишеней различных убиквитин-модифицирующих ферментов и убиквитин-подобных белков (UBL) в ядрах эукариотических клеток человека с применением метода биотинилирования от сближения (PUB). Получены, секвенированы и наработаны семь новых плазмидных конструкции. Впервые осуществлена экспрессия рекомбинантных белков BAP-Ub, BirA-wtPolH, BirA-PIPmutPolH, BirA-UbZmutPolH в клетках НЕК293Т транзиентной трансфекцией с помощью кальций-фосфатного метода с последующим мечением биотином. Установлено, что преимущественное биотинилирование BAP-Ub-PCNA с помощью BirA-POLH зависит от целостности UBZ- и PCNA-связывающих доменов белка POLH, т.е. от связывания между этими двумя белками. По результатам эксперимента с применением стабильных изотопов SILAC из очищенных образцов, содержащих, биотинилированные белки с тяжелым изотопом идентифицирован пептид соответствующий белку BAP-Ub-PCNA, взаимодействующий с ДНК-полимеразой дикого типа wtPOLH. Результаты работы будут применены в разработке новых ингибиторов элементов системы, связанных с белком убиквитином человека, в качестве средств, для лечения различных видов онкологических заболеваний.